新型冠狀病毒核酸檢測方案

    2019年底在湖北省武漢市爆發的新型冠狀病毒被列為乙類傳染病，具有高傳染性，按照國家規定，需采用甲類傳染病的預防，控制措施。

    那么，怎樣在“金標準”核酸檢測方法下做好病毒檢測工作呢？

    根據目前研究已知，該病毒基因組大小約為30kb，具有ORF1a/b非結構蛋白編碼區；結構蛋白E（Envelop），M（膜蛋白），N（核衣殼），S（表面蛋白）編碼區；輔助蛋白orf 3, 6, 7a, 7b, 8和9b編碼區。因此，檢測的探針引物設計必須保證準確性和特異性。羅氏的TIB檢測試劑盒在設計時，參照已發表的病毒基因組序列設計了三組探針引物，分別是E基因，RdRP基因（位于ORF1ab）和N基因。其中E基因保守性強，用于初步篩查；RdRP基因特異性強，用于COVID-19（WHO最新命名）的檢測；N基因特異性較強，用于復檢防止漏檢，也可檢測類SARS病毒。整體設計比較嚴謹合理，符合當下的檢測需要。

    當拿到檢測試劑盒后，又要怎樣開展實驗呢？下面是一個簡易的流程圖：

    首先，樣本采集。樣本類型主要分為呼吸道樣本，血液樣本和糞便樣本。

    呼吸道樣本：

    1. 上呼吸道標本：包括咽拭子、鼻拭子，鼻咽或口咽抽吸物或洗液等。

    2. 下呼吸道標本：支氣管肺泡灌洗液、呼吸道抽取物、痰液和肺組織活檢標本。

注意： 拭子標本只能用帶有鋁桿或塑料桿的人造合成拭子頭（例如聚酯纖維或滌綸）收集。不允許使用木桿的海藻酸鈣或棉質的拭子頭。

    血液樣本：

    盡量采集發病后7天的急性期抗凝血。采集量5 ml， 以空腹為佳，建議使用含有EDTA抗凝劑的真空采血管血液。

    糞便樣本：

    出現腹瀉癥狀的患者需采集糞便標本（肛門拭子）。

   （同時，要注意的是，標本采集后在4℃最多保存72小時；如果不能及時檢測，則將標本在-70 ℃或以下保存；提取的核酸應在-70℃或以下保存。）

    再次，是樣本前處理。

    根據國家衛健委的建議，要經過56℃，30分鐘的滅活處理；或者按照WHO的方案，可加入含有（硫氰酸胍，異硫氰酸胍）胍鹽的裂解液，高溫孵育， 60℃ 60 min。為了最大程度上保證實驗人員的安全，推薦使用羅氏提供的MagNA Pure 96 External lysis buffer（含胍鹽）進行外部裂解與滅活。

    然后，進入到核酸提取階段，分為手工提取法和全自動核酸提取。

    核酸提取是整個實驗流程中比較關鍵的步驟，若提取效果不佳，會影響到后續的實驗和結果分析。

    手工提取可以采用市售各品牌手提試劑盒，也可以選擇羅氏的High Pure Viral RNA Isolation Kit手提試劑盒，該試劑盒采用的是柱式提取法，效果比較穩定。

    全自動核酸提取會越來越多應用在臨檢部門，特別是針對這種突發情況，可以做到在短時間大批量（1個小時96個樣品）的開展核酸提取工作。我們推薦的病毒核酸自動提取方案如下：

（其中設備下的提取Protocol全部經過驗證，可以滿足此次疫情的核酸提取需要。）

    接下來，得到滿足檢測要求的核酸后，就可以開展定量PCR實驗檢測樣本了。根據不同實驗室的要求，對樣本的布板可以采取以下形式：

注意：1. NTC至少1個；PC一個；陽性質控品開蓋前離心，防止污染。

      2. 室間質評：NC三個隨機放置；LPC 一個

（北京市開展新型冠狀病毒（2019-nCoV）核酸檢測質量控制的工作方案（試行第一版）

    在熒光定量PCR儀上的設置按如下程序進行：

    反轉錄，55℃，5min——預變性，95℃，5min——擴增，95℃，5s；60℃，15s，采集信號；72℃，15s（45Cycler）——冷卻，40℃，30s。

可適用于羅氏品牌下的LightCycler 480 I，LightCycler 480 II，LightCycler 96和Cobas Z480等機型上。

   結果的判讀，遵循綜合判定法，即：

   最后為實驗后的消毒處理，所有操作臺面用75%酒精或其他消毒液噴灑消毒，所有個人防護用品經高壓滅菌后處理，放入三層醫療廢物袋中集中處理。（可參考北京協和醫院發布的個人防護方案和檢測后處理方案。）